前言

新冠mRNA疫苗在疫情爆发后短短一年内完成了紧急使用，刷新了疫苗研发速度的记录，给了民众足够的保护，毫无疑问地成为了新冠疫情控制中的MVP。mRNA药物也更多的走进广大的从业者和投资者的视野，有更多的机会展示其特别的魅力。

虽然新冠mRNA疫苗是在短短一年完成了紧急使用，但其技术的积淀已经有60年的历史。在这60年里，科学家们攻破了这些难关，才让理论上的可能性，转变成我们身边的疫苗。

mRNA是生物学中心法则的经典应用，技术的应用主要受制于序列设计及修饰和递送方式两个方面。序列设计及修饰中序列设计是为了更好的得到目标蛋白，而修饰是为了调整mRNA的免疫原性，调整免疫反应的烈度，保障人身安全。递送方式是科学家最早意识到的问题，由于mRNA是一个带负电的大分子，本身在自然环境中的不稳定，也无法通过带负电的细胞膜。因此需要一个巧妙的技术能够使mRNA被递送进细胞内，并且在细胞内恢复其mRNA的蛋白质翻译功能。因此递送技术变得尤为关键，需要平衡好包装效率、递送效率、内体逃逸、毒副作用、稳定性等一系列方面。

基于此，我们今天将从递送技术的发展，以及LNP的技术机理、质量分析和制备方法等方面展开深入探讨。

递送技术的发展

递送技术是一个专门的学科，从1950年到现在已经有70年的历史，经历了3个阶段。控制释放技术（Drug Release Mechanisms），纳米药物（Nanomedicine），精准医疗（ Precision Medicine & Health Equity）。我们当前的mRNA疫苗处在从纳米药物向精准医疗过渡的阶段。

mRNA的递送技术最早从鱼精蛋白（1961年）开始，经历了脂质体封装研究（1978年）-阳离子脂质应用（1989年）-LNP包封SiRNA药物FDA批准（2018年），再到2020年底，成形的LNP递送技术应用在了Pfizer和Moderna的新冠mRNA疫苗上。新冠疫苗的成功，让公众和投资界更加关注到递送技术的应用。

当前在研究和应用的mRNA，DNA相关的递送技术主要研究方向有下面几个，LNP（脂质纳米颗粒）、LPP（脂质多聚复合物）、PNP（聚合物纳米粒）、INP（无机纳米粒）、病毒载体、外泌体、GalNac（N-乙酰半乳糖胺）。

LNP，LPP，PNP和INP应用了类似的原理。其中LPP，PNP和INP从包封的材料入手，以取得更好的适应性和更低的材料制造成本，也为了能够回避LNP的专利影响。

病毒载体技术由于病毒资源的有限，当前主要方向应用于基因治疗。

外泌体技术由于其模仿细胞本身生理过程，具备更多的可能性，而受到了广泛的关注，但由于其工程化方式还有许多问题需要解决。

GalNac技术解决了细胞膜的穿透问题，但由于其通过化学键结合方式进行穿透，并未对mRNA分子本身起到保护作用，因此广泛的应用于siRNA和miRNA的递送，暂时还没能有效应用于mRNA这种大分子的递送。

综上所述，以LNP为代表的纳米颗粒递送技术成为现在mRNA疫苗的主流技术。由于LNP的原材料要么是像胆固醇和磷脂这种身体内存在的成分，要么是PEG修饰磷脂和可电离脂质这种有大量药品应用背景的成分，这样LNP相对于其他几种纳米颗粒递送技术在FDA审批时的接受度要高很多。再加上新冠疫苗的成药先例，以及普及接种带来的大量安全性数据反馈，让LNP这条递送技术在当前比其他技术更加容易通过药物审批。

但LNP递送技术当前并未做到靶向性，疫苗可以不用在乎靶向性，只要能够有效的传递到细胞和表达足够量的抗原即可。一旦进入到mRNA药物治疗阶段，LNP或其他递送技术则必须要考虑相应的方案，或者是靶向性的修饰，或者使药物更多的向病灶聚集。其中因为LNP纳米级尺寸而出现的肝脏富集受到了很多研究肝脏疾病科学家的关注。而随着这些机理的进一步研究，必然对后续的制备技术提出更加详细和具体的要求。

接下来，我们将从以下几方面对LNP技术做进一步了解：

1. LNP技术机理

LNP（Lipid NanoParticle）的组成有四种成分，形成了一个整体纳米颗粒，起到了保护mRNA和穿透细胞膜的功能。

以下四种组分有各自独立的功能，也有配合的功能，谈及LNP，我们通常都说的是这样的一个配方所形成的整体结构。

1）可电离阳离子脂质

具有pH敏感性，可以和带负电的mRNA结合，进行高效包封，同时可以在细胞内的酸性环境里质子化，帮助实现胞内逃逸，是LNP设计里的核心部分。

2）中性磷脂（DSPC）

在正常环境下稳定，在酸性环境下，配合阳离子脂质实现胞内逃逸。

3）胆固醇

稳定LNP颗粒的结构，给双分子膜一定的流动性，能更大抵抗外部的干扰。

4）PEG修饰树脂

提高LNP稳定性，避免被人体系统过早清除，充分发挥疫苗作用。

参见下面上市疫苗的组分配比，可以发现其脂质体成分是基本一致的，主要的差异在于可电离阳离子脂质，各配方组分比例也接近，容易形成稳定的结构。

（Moderna和BioNTech上市疫苗成分对比）

LNP优于传统脂质体的原因在于其形成机理，有可电离脂质和mRNA的电荷作用，而传统脂质体需要靠强烈剪切或溶剂蒸发才能实现药物的包覆和成形，因此LNP的形成是一个温和的自发过程。LNP的温和工艺，也提供了对mRNA的充分保护。

-   脂质混合-胆固醇/中性辅助磷脂/PEG化磷脂/可电离脂质溶解在乙醇相。

-   mRNA 溶解在水相介质，pH=4的缓冲液（参见上面2种缓冲液体系）。

-   水相和乙醇相进行混合，混合过程中一方面，可电离脂质接触到酸性环境表现了质子性，在静电作用下结合到mRNA上，一方面由于脂类进入到水相环境后，开始自团聚。通过这样的方式形成了纳米颗粒。

-   PEG树脂由于其空间结构和PEG修饰端的属性，参与到纳米颗粒生成过程，对粒径控制范围起到了帮助。

结合原理的分析，如何让水相和醇相从更小尺度上快速达到均一，是LNP制备效果保证的重点。

2. LNP的质量分析

LNP形成的纳米颗粒需要在体内完成需求的生理功能，需要满足下面几个属性需求：

这些属性或多或少都会受到LNP制备过程中的影响。

目前为止对包封率讨论的很多，但对于每个颗粒内包含的mRNA数量并未做讨论。一方面是测量mRNA包含数量就有一定的困难，另一方面对于疫苗的有效性更多是依靠总的mRNA数量，因此单个颗粒包含mRNA的数量并不是像ADC药物的DAR值那样的关键参数。包封率可以体现出疫苗内的活性成分含量和制备效率，已经是可以用来作为质量衡量的基准。

其中关于储存条件的讨论是一个比较有意思的话题。目前，有的厂家要求-70~-80度的保存条件，有的厂家要求-20度，有的厂家要求2-8度，且有着不同的保存时间。可见，配方的略有不同，造成产品稳定性也存在差异。由于mRNA的LNP颗粒是通过疏水性和电荷吸引的力量形成的弱结合的球体，是比较容易被打破的。另外LNP颗粒尺寸已经在100nm左右的尺度，在这个尺度上，分子热运动的影响已经不能再被忽略，LNP纳米粒越稳定，对疫苗的储存温度就可以要求不这么严格。对稳定性的研究通常需要更多的配方和制备工艺的研究，也需要更长的时间来完成。

3. LNP的制备方法

从LNP的制备机理出发，各个实验室和科学机构开发了各种各样的混合方式来实现LNP的制备，有代表性的几种设计参见下文:

1）传统的Y型接口和T型接口对撞流设计

2）以特殊结构优化的对撞流设计

3）以内嵌结构扰动增加方式的微通道混合技术

4）以特斯拉结构为代表的分离重组结构微通道混合技术

对比几种结构的混合能力评估情况见下表：

这几种混合结构在行业内都有应用，在一定条件都可以达成合适的包封效率和粒径控制指标。但往往都需要较多的试验来确定混合结构和最终控制参数，对药物开发时间和开发成本都有较大影响，并且在放大的过程中，没有完全可靠的物理模型，导致放大过程中的浪费比较严重。

但随着LNP结构的进一步揭示，以及对纳米颗粒形成过程的进一步分析，希望会有更加明确的指导方向，来减少试验摸索的次数和时间，提高研发的成效。

对未来的展望

mRNA药物的开发如火如荼，新的递送配方和新的原料也在不断尝试。递送系统尤其是当前主流的LNP技术，如何响应配方和原料的变化，不断进步，不成为药物研发和生产的瓶颈，是当前至关重要的方面。也只有基础理论、先进工具和实验相结合的方法，才能帮助到LNP递送技术的进一步开发。

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